有毒蜜源植物——博落回花粉颗粒电镜扫描观察
姚丹1张锦华2袁扬2赵恬2张定红2徐祖荫3王胤晨2
（1 贵州省现代农业发展研究所；2 贵州省农科院畜牧兽医研究所；3 贵州省养蜂学会，贵阳 550000）
摘要：夏季误食有毒蜂蜜致人中毒死亡事件，已在多个省市均有所报道。鉴定蜂蜜是否有毒，除蜂蜜的成分外，蜂蜜中有毒蜜源的花粉鉴定也是其中一个重要步骤。本次以有毒蜜源植物博落回花粉颗粒为研究对象，探讨并丰富花粉鉴别有毒蜂蜜的鉴定标记。采用扫描电镜技术，通过在不同放大倍数下，观察博落回花粉颗粒及花粉表面切片形状。结果显示，扫描电镜放大1000x时，博落回花粉颗粒呈圆球形的大都串珠相连，呈长球形的大都呈簇状；放大4000x时，花粉颗粒呈圆球形，且上边布满小孔，呈蜂窝状；对花粉颗粒表面切片后，放大20000x时，其花粉表面纵饰呈结绳状或姜块状，具有圆孔。因此， 进一步丰富了花粉鉴别有毒蜂蜜的鉴定标记，对鉴定蜂蜜产品安全具有重要的指导意义。
关键词：博落回；花粉；扫描电镜；有毒蜜源植物
Scanning Electron Microscopic Observation on Pollen Grains
of Macleaya cordata
Yao Dan1,Zhang Jinhua1,Yuan Yang1,Zhao Tian1,Zhang Dinghong1,Xu Zuyin2, Wang Yinchen1
Abstract: Probiotics are a class of microorganisms with probiotic effect in certain doses, which have been widely used in the field of animal breeding to promote host nutrient metabolism, improve host health and improve the structure of host intestinal bacteria. Probiotics are receiving more and more attention in apiculture. Studies have shown that disorders of honey bee gut microorganisms reduce bee longevity and productivity, and feeding probiotic products to honey bees has a regulatory effect on increasing the abundance of honey bee gut microorganisms and improving health of honeybees. This paper describes the role of probiotics in improving intestinal health, promoting nutrient absorption, and improving immunity of honeybees, and presents the current status of probiotic applications in beekeeping production and the prospect of probiotic applications.
Key words：probiotics; apiculture production; intestinal microorganism; application
蜜蜂是典型的社会群居性昆虫，不但能为我们提供丰富的蜂产品，而且作为一种重要的授粉昆虫，对整个世界的农业生产和生态环境均具有重要意义。但在过去几十年里，随着现代农业的快速发展，一些化学物质的使用对蜜蜂的肠道微生物造成了不良影响，降低了蜜蜂寿命[1]。益生菌是一类在一定剂量具有益生作用的活的微生物总称，已在动物养殖领域广泛应用，具有促进宿主营养代谢、提高宿主健康水平并改善宿主肠道菌群结构的功能[2]。本文阐述了益生菌在改善蜜蜂肠道健康、促进蜜蜂营养吸收、提高蜜蜂免疫力方面的作用，对益生菌在养蜂生产中的应用现状进行介绍，并对益生菌的应用前景进行展望。
1 益生菌在畜牧业上的应用
1954年，Vergin在他的文章“Anti-und Probiotika”中首先用到“probiotic”（益生菌）一词，并在书中介绍了几种有使用价值的细菌。到了1965年，Lilly和Stillwell将可以为其他微生物提供生长因子的有益微生物称为益生菌[3]。进入现代，随着对益生菌研究的深入，联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）将益生菌定义为在一定合适的剂量下可以给宿主带来益处的活的微生物菌类[4]。
益生菌在畜牧业上的使用已经较为广泛。在奶牛的饲料中添加益生菌可以提高奶牛的产奶量，并改善瘤胃内微生物菌落结构[5]；益生菌还可以提高家禽的生产性能，增强家禽肠道屏障功能，改善家禽的健康状态[6]；除此之外，科学使用益生菌还可以提高仔猪的免疫力，促进肠道菌群平衡和营养物质的吸收，从而降低仔猪的死亡率[7]。正是益生菌在其他动物上的广泛应用，其在养蜂生产中也受到越来越多的关注。
2 蜜蜂的肠道菌群
2.1 蜜蜂肠道菌群的组成
蜜蜂的肠道菌落大部分集中在后肠，丰度低且特异性高。16s DNA基因测序结果显示，成年工蜂的体内共有9大类，涉及5个纲：分别是Gamma-1(Gilliamella apicola)，Bata(Snodgrsella alvi)，Firm-4，Firm-5，Bifidobacterium，Alpha-2.1(Bartonella apis)，Alpha-2.2(Parasaccharibacter apium)，Apibacter adventoris，Gamma-2(Frischella perrara)[8]。不同的细菌在肠道内定植的地点不同，比如在回肠中主要定植的是S.alvi和G.apicola，而在直肠主要定植的是Firm-4、Firm-5 和Bifidobacteriu[9]。
相比于后肠，仅有少量细菌存在于蜜囊中。Vasquez等人通过微生物培养的方式，发现蜜囊中主要的微生物菌群是由乳酸菌属（Lactobacillus）和双歧杆菌属（Bifidobacteriu）构成[10]。2014年Corby-Harris进一步对蜜囊中的微生物进行分析，发现除乳杆菌属外，还存在醋杆菌科（Acetobacteraceae）和少量来自环境中的肠杆菌科细菌（Enterobacteriaceae）[11]。蜜囊中的微生物菌群还会随着外界蜜粉源以及蜜蜂健康状况的变化而变化[12]。
2.2 蜜蜂肠道菌群的功能
对蜜蜂核心菌G.apicola、Lactobacillus和Bifidobacterium的基因组和代谢研究表明，它们具有消化和代谢多种碳水化合物的能力[13]。在相同饲养条件下，正常工蜂在肠道大小、体重增加、胰岛素和卵黄原蛋白信号的表达以及对蔗糖的敏感性上要强于无菌蜂[14]。有些核心菌含有多种碳水化合物的代谢基因，而相同细菌不同菌株也具有不同的碳水化合物的代谢能力。除此之外，肠道菌群还能对中肠无法消化的花粉进行代谢。Engel等通过体外试验发现G.apicola可以代谢花粉当中的果胶[15]；Kesnerova等通过比较肠道内容物种类，发现正常工蜂体内的发酵物和类花生酸的含量增加，而无菌蜂体内黄酮类物质和花粉壁组成物质的含量上升，进一步证实了肠道菌群可以消化花粉[16]。
蜜蜂的肠道菌群除了参与宿主的营养代谢以外，在维持宿主健康上也有重要作用。F. perrara是一种定植在中肠和回肠之间靠近幽门区域的特殊细菌，它可以使蜜蜂肠道上皮产生一种黑色类似“结痂”的结构，该结构的产生可能是刺激包括黑化反应在内的免疫途径的结果[17]。肠道微生物可以提高蜜蜂免疫力的一个重要原因是可以刺激蜂体免疫系统的表达。当蜜蜂幼虫暴露在有病原菌的环境中时，幼虫体内的抗菌肽表达水平明显提高[18]；Evans等发现如果蜂群中工蜂体内抗菌肽Abaecin的表达提高，那么蜂群的幼虫芽杆菌（Paenibacillus larvae）的发病率就会降低；而维持肠道微生物的稳定对AMPs正常表达具有重要作用[19]。
2.3 益生菌在蜜蜂体内的作用机制
益生菌对蜜蜂的益生作用，可能与其产生的抗菌化合物有关。比如乳酸菌可以产生乳酸和乙酸，这些有机酸可以增加蜜蜂消化道的酸度，创造不利于病原微生物生长的内部环境，从而使蜜蜂防御力增强[20]。除了有机酸，过氧化氢、二乙酰苯甲酸酯和细菌素等，都有可能在蜜蜂体内发挥积极作用。
益生菌还会激活蜜蜂抗菌肽基因的表达，从而提高蜜蜂的免疫力。抗菌肽大部分是带正电或者是亲水亲脂性的多肽，可以和细菌细胞膜上带电的脂多糖相结合改变细胞膜的通透性，导致细菌的死亡[21]。所以蜜蜂体内抗菌肽含量的上升可以使蜜蜂对细菌的防御力上升。益生菌激活抗菌肽基因的表达可能与介导Jak/STAT、TOLL、IMD通路等免疫通路有关[22]。
3 益生菌在养蜂业中的应用种类
3.1 乳酸菌属
乳酸菌属是蜂群环境中最常见的细菌属，占蜂蜜细菌总数的90%~99%，花粉的74%~76%，蜂粮的83%~89%，蜂王浆的93%，以及整个蜜蜂肠道的30%~33%。蜜蜂体内的乳酸菌主要定植在直肠中，共有14种；少量存在于蜜囊中，但也有12种之多[13]。乳酸菌作为一种常见的益生菌常用于蜜蜂生产中。
Audisio等在饲喂蜂群的蔗糖溶液中添加 L. Johnsonii CRL1647会使蜂群内的群势、封盖子量以及蜂蜜产量增加[23]；而由L. kunkeei Dan39、L. johnsonii Dan92等组成的复合微生态制剂可以使蜜蜂肠道内双歧杆菌属和醋酸杆菌属的数量增加，乳酸菌属的数量减少[24]；L. reuteri LP4可以改善中华蜜蜂的肠道菌群结构、增强肠道免疫功能，提高工蜂的存活率[25]。除此之外，乳酸菌更多是用来抵御病原菌的入侵。L. Biut2和L. Hma11以及L. brevis和L. plantarum的组合，通过体外培养发现都对幼虫芽孢杆菌（Paenibacillus larvae）具有抑制作用[20]；Endo和Salminen发现L. kunkeei FF30-6可以在体外抑制蜂房蜜蜂球菌（Melissococcus plutonius）的生长[26]；而L. salivarius A3iob还会减少蜂群中蜂螨和微孢子虫（Nosema spp）的寄生[27]。
3.2 芽孢杆菌属
除乳酸菌属外，芽孢杆菌属是另一类可以用到蜜蜂养殖过程中的益生菌。芽孢杆菌可以生活在不同的环境中，现已证实芽孢杆菌与蜂巢内花粉的发酵、蜂产品的存储以及增强蜂群疾病防御能力有关[28]。
Sabate等用含有B. subtilis Mori2的蔗糖溶液连续饲喂蜂群8个月后，发现饲喂益生菌的蜂群内蜂王产卵能力和群势都有明显增加，并降低了蜂群的蜂螨发病率[29]。除了能提高蜂群生产性能以外，芽孢杆菌还可以用来抵御病原菌。B. subtilis和B. cereus的组合在实验室环境下被证实可以抑制幼虫芽孢杆菌的活性[30]，B. subtilis Acja3可以降低蜂房蜜蜂球菌的活性[31]。Alippi等人还证实了从蜂群当中分离出B. megaterium和B. licheniformis具有抑制美洲腐臭病发生的作用，并进一步验证了B. cereus可以对幼虫芽孢杆菌产生抑制作用[32]。
3.3 其他益生菌种类
除了单独使用乳酸菌和芽孢杆菌以外，人们还使用商业性复合益生菌制剂饲喂蜜蜂。在国外，蜜蜂饲喂益生菌制剂Enterobiotics之后，蜡腺分泌细胞的发育增强[33]；在实验室条件下，益生菌制剂Biogen-N还可以增加蜂体干物质重以及粗脂肪含量，并降低蜜蜂死亡率[34]；除此之外，益生菌制剂EM®可以降低微孢子虫在蜜蜂体内的寄生，延长蜜蜂寿命[35]。在我国，有学者将EM®微生物混合制剂用到蜜蜂的生产中，发现可以提高蜂群群势，并增加工蜂中肠围食膜的厚度[36]。但并不是所有的益生菌都对蜜蜂有益。据报道，将鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus）饲喂给蜜蜂并不能抑制微孢子虫的繁殖，而且还能破坏蜜蜂的免疫系统、增加蜜蜂死亡率[37]，所以蜜蜂养殖选择合适的益生菌至关重要。
4 益生菌在养蜂业中应用前景展望
总体来说，益生菌更多是用来研究如何增强蜜蜂抵御病原菌的能力，而在实际生产上的应用相对较少。在益生菌的使用过程中，使用剂量从105 CFU/ml 到107 CFU/ml不等，且饲喂间隔以及持续时间也不尽相同，这些益生菌饲喂当中的不确定性都制约了其在蜂群上的应用。另一个影响益生菌应用的问题是益生菌种类的选择。由于天然蜂蜜中含有杀菌物质使微生物难以生长[38]，所以需要选择能在蜂箱内长期生存的益生菌，例如可以产生芽孢的菌类，但这些益生菌又有可能会对人类健康产生威胁。所以如何选择正确的益生菌就成了一个关键性的问题。
随着蜜蜂养殖过程中抗生素的大量使用，人们对蜂产品当中的抗生素残留问题越来越重视。为了解决此问题，人们积极的选择抗生素的替代者，而益生菌就是其中之一，但现在能应用于蜜蜂生产的益生菌种类以及使用方法还不是很明确。根据蜜蜂生理特点、生物学特性以及蜜蜂营养需要，在国内外试验数据的基础上，通过实际益生菌的应用效果，筛选出能用于蜜蜂生产的益生菌种类就显得十分重要。
参考文献
[1] Raymann K, Moran N A. The role of the gut microbiome in health and disease of adult honey bee workers [J]. Current Opinion in Insect Science, 2018, 26: 97-104.
[2] Georgieva M, Georgiev K, Dobromirov P. Probiotics and Immunity [M]. Probiotics and Immunity, 2015.
[3] Lilly D M, Stillwell R H. Probiotics: growth-promoting factors produced by microorganisms [J]. Science, 1965, 147(3659): 747-748.
[4] Azad M A K, Sarker M, Li T, et al. Probiotic species in the modulation of gut microbiota: an overview [J]. Biomed Research International, 2018: 9478630.
[5] 夏元军，王丽颖，王洋. 复合益生菌对奶牛产奶量、乳成分及粪便菌落的影响[J]. 饲料博览，2020(4): 31-34.
[6] 孙笑非，王文娟，孙冬岩，等. 益生菌在家禽饲料中应用的研究进展[J]. 饲料研究，2021, 44(4): 107-110.
[7] 王斐，徐树杰，李响，等. 益生菌在猪上的应用效果和作用机理研究进展[J]. 动物营养学报，2021: 1-13.
[8] 王红芳，胥保华. 蜜蜂肠道微生物与其社会性的关系[J]. 生物技术通报，2020, 36(2): 71-76.
[9] 吴雨祺，郑宇斐，郑火青，等. 蜜蜂肠道菌群结构功能研究进展[J]. 环境昆虫学报，2020, 42(2): 364-369.
[10] Vásquez A, Forsgren E, Fries I, et al. Symbionts as major modulators of insect health: Lactic acid bacteria and honeybees [J]. PLoS One, 2012, 7(3): e33188.
[11] Corby-Harris V, Maes P, Anderson K E. The bacterial communities associated with honey bee (Apis mellifera) foragers [J]. PLoS One, 2014, 9(4): e95056.
[12] Gaggìa F, Baffoni L, Alberoni D. Probiotics for honeybees’ health [M]. Springer International Publishing, 2018: 219-245.
[13] Moran N A. Genomics of the honey bee microbiome [J]. Current Opinion Insect Science, 2015, 10: 22-28.
[14] Zheng H, Powell J E, Steele M I, et al. Honeybee gut microbiota promotes host weight gain via bacterial metabolism and hormonal signaling [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2017, 114(18): 4775-4780.
[15] Engel P, Martinson V G, Moran N A. Functional diversity within the simple gut microbiota of the honey bee [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2012, 109(27): 11002-11007.
[16] Kešnerová L, Mars R A T, Ellegaard K M, et al. Disentangling metabolic functions of bacteria in the honey bee gut [J]. PLoS Biology, 2017, 15(12): e2003467.
[17] Emery O, Schmidt K, Engel P. Immune system stimulation by the gut symbiont Frischella perrara in the honey bee (Apis mellifera) [J]. Molecular Ecology, 2017, 26(9): 2576-2590.
[18] Jefferson J M, Dolstad H A, Sivalingam M D, et al. Barrier immune effectors are maintained during transition from nurse to forager in the honey bee [J]. Plos One, 2013, 8(1): e54097.
[19] Evans J D. Beepath: An ordered quantitative-PCR array for exploring honey bee immunity and disease [J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2006, 93(2): 135-139.
[20] Forsgren E, Olofsson T C, Váasquez A, et al. Novel lactic acid bacteria inhibiting Paenibacilluslarvae in honey bee larvae [J]. Apidologie, 2010, 41(1): 99-108.
[21] Shen X, Ye G, Cheng X, et al. Characterization of an abaecin-like antimicrobial peptide identified from a Pteromalus puparum cDNA clone [J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2010, 105(1): 24-29.
[22] Kingsolver M B, Huang Z, Hardy R W. Insect antiviral innate immunity: pathways, effectors, and connections [J]. Journal of Molecular Biology, 2013, 425(24): 4921-4936.
[23] Audisio M C, Mr B. Lactobacillus johnsonii CRL1647, isolated from Apis mellifera L. bee-gut, exhibited a beneficial effect on honeybee colonies [J]. Beneficial Microbes, 2011, 2(1): 29-34.
[24] Alberoni D, Baffoni L, Gaggia F, et al. Impact of beneficial bacteria supplementation on the gut microbiota, colony development and productivity of Apis mellifera L. [J]. Benefical Microbes, 2018, 9(2): 269-278.
[25] 雷清芝，汪思凡，殷桦娟，等. 罗伊氏乳杆菌LP4对东方蜜蜂成年工蜂存活率、肠道菌群结构和抗菌肽mRNA表达量的影响[J]. 云南农业大学学报（自然科学），2020, 35(5): 796-803.
[26] Endo H, Niioka M, Kobayashi N, et al. Butyrate-producing probiotics reduce nonalcoholic fatty liver disease progression in rats: new insight into the probiotics for the gut-liver axis [J]. PLoS One, 2013, 8(5): e63388.
[27] Tejerina M R, Cabana M J, Benitez-Ahrendts M R. Strains of Lactobacillus spp. reduce chalkbrood in Apis mellifera [J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2021, 178: 107521.
[28] Gilliam M. Identification and roles of non-pathogenic microflora associated with honey bees [J]. FEMS Microbiology Letters, 1997, 155(1): 1-10.
[29] Sabate D C, Cruz M S, Benitez-Ahrendts M R, et al. Beneficial effects of Bacillus subtilis subsp. subtilis Mori2, a honey-associated strain, on honeybee colony performance [J]. Probiotics Antimicrob Proteins, 2012, 4(1): 39-46.
[30] Yoshiyama M, Kimura K. Bacteria in the gut of Japanese honeybee, Apis cerana japonica, and their antagonistic effect against Paenibacillus larvae, the causal agent of American foulbrood [J]. Journal of Invertebrate Pathologu, 2009, 102(2): 91-96.
[31] Wu M, Sugimura Y, Takaya N, et al. Characterization of bifidobacteria in the digestive tract of the Japanese honeybee, Apis cerana japonica [J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2013, 112(1): 88-93.
[32] Alippi A M, Reynaldi F J. Inhibition of the growth of Paenibacillus larvae, the causal agent of American foulbrood of honeybees, by selected strains of aerobic spore-forming bacteria isolated from apiarian sources [J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2006, 91(3): 141-146.
[33] P Truic S, Mot D. The effect of using prebiotic and probiotic products on intestinal micro-flora of the honeybee (Apis mellifera carpatica) [J]. Bulletin of Entomological Research, 2012, 102(6): 619-623.
[34] Szymaś B, Bangowska A, Kazimierczak-Baryczko M. Histological structure of the midgut of honey bees (Apis mellifera L.) fed pollen substitutes fortified with probiotics [J]. Journal of Apicultural Science, 2012, 56(1): 5-12.
[35] Tlak Gajger I, Vlainić J, Aoštarić P, et al. Effects on some therapeutical, biochemical, and immunological parameters of honey bee (Apis mellifera) exposed to probiotic treatments, in field and laboratory conditions [J]. Insects, 2020, 11(9): 638.
[36] 杭柏林，李杰，胡建和，等. EM在蜜蜂养殖上的应用[J]. 中国蜂业，2008, 59(12): 28-29.
[37] Ptaszyńska A A, Borsuk G, Zdybicka-Barabas A, et al. Are commercial probiotics and prebiotics effective in the treatment and prevention of honeybee nosemosis C [J]? Parasitology Research, 2016, 115(1): 397-406.
[38] Snowdon J A, Cliver D O. Microorganisms in honey [J]. International Journal of Food Microbiology, 1996, 31(1-3): 1-26.
编辑：李瑞珍
基金项目：泰山产业领军人才高效生态农业创新类项目（编号：LJNY202003）；财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系建设资金
作者简介：韩凯（1992-），男，硕士研究生，主要从事蜜蜂营养与饲料科学研究，E-mail: 1341951880@qq.com
通讯作者：胥保华，教授，博士生导师，E-mail: bhxu@sdau.edu.cn